� Univ�rsidad � Continental FACULTAD DE INGENIERÍA Escuela Académico Profesional de Ingeniería Ambiental Tesis Relación de la morf orne tría fo liar de Polylepís rodolfo-vasquezii Valenzuela & Villalba y Polylepís íncana Kunth con la altitud y el número cromosómico en la región Junín Jesid Angel Ticse Huamán Huancayo, 2018 Para optar el Título Profesional de Ingeniero Ambiental - - - - Creative Commons Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Perú 2 AGRADECIMIENTOS Este trabajo de investigación fue todo un proceso de desarrollo y aprendizaje, el cual no hubiera sido posible sin el apoyo de grandes instituciones y excelentes profesionales. Inicio con mis agradecimientos al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) por el financiamiento del proyecto del proyecto de investigación, institución con gran crecimiento y promoción del desarrollo de la ciencia y tecnología en el Perú, al Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas (SERNANP) por la autorización de ingreso a las Áreas Naturales Protegidas para poder desarrollar el proyecto, al Servicio Nacional Forestal y de Fauna Silvestre (SERFOR) por el otorgamiento de permiso para la recolección de especímenes de flora con fines de investigación y a la Universidad Continental que me dio la oportunidad de participar en este proyecto de investigación, espero que siga creciendo como lo hace cada año. Y directamente al Instituto de Investigación por promover la investigación entre sus estudiantes y darnos las facilidades para hacerlo. Mi muy especial agradecimiento a mi asesora M. Sc. Verónica Canales Guerra, al Coordinador del proyecto M.Sc. Boris Gutarra Castillo, a la Ph.D María Claudia Segovia Salcedo por los consejos y ayuda en las dudas que se me presentaron y los Co-investigadores el Ing. Harold Rusbelth Quispe Melgar y la Bach. Fressia Nathalie Ames Martínez por el apoyo, consejos y constantes enseñanzas en bien del desarrollo del proyecto. Finalmente, mis agradecimientos a los compañeros y tesistas del proyecto Dolly Landeo Julcarima, Diana Rivera Villanes, Madeleyne Mamani Salas, Wendy Navarro Romo y Carlos Álvarez Montalván por la amistad y apoyo en el proyecto, asimismo a las autoridades y pobladores de los distritos y comunidades de Paccha, Pomamanta y Toldopampa por la autorización de ingreso a los bosques de Polylepis sp. 3 DEDICATORIA Dedico esta tesis a mis padres Carlos Ticse Núñez, Delia Huamán Cano y Alejandro Mariño Rodríguez quienes me enseñaron que en la vida no se puede dar marcha atrás porque es una calle de sentido único y que cada problema que se presenta en él es una oportunidad. A mis hermanos quienes tuvieron la molestia de regalarme mucho de su tiempo y tolerarme, sin ellos no hubiera logrado mis objetivos profesionales. 4 INDICE AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... 2 DEDICATORIA .................................................................................................................. 3 INDICE ................................................................................................................................. 4 INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... 6 ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................... 9 RESUMEN ......................................................................................................................... 12 ABSTRACT ....................................................................................................................... 13 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 14 CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO ................................................... 16 1.1 Planteamiento y formulación del problema............................................................ 16 1.2 Objetivos ................................................................................................................ 19 1.3 Justificación e importancia ..................................................................................... 20 1.4 Descripción de variables ........................................................................................ 22 CAPITULO II MARCO TEÓRICO .............................................................................. 24 2.1 Antecedentes de la investigación. .......................................................................... 24 2.2 Bases teóricas ......................................................................................................... 29 2.2.1 Descripción del área de estudio ......................................................................... 29 2.2.2 Fundamentos teóricos ........................................................................................ 31 2.2.3 Metodologías existentes .................................................................................... 45 2.2.4 Técnicas e instrumentos de investigación ......................................................... 58 2.2.5 Diseño de modelo teórico conceptual ............................................................... 47 2.3 Definición de términos básicos .............................................................................. 48 CAPITULO III METODOLOGÍA ................................................................................. 50 3.1 Método y alcances de la investigación ................................................................... 50 3.1.1 Método de la investigación ............................................................................... 50 3.1.2 Alcances de la investigación ............................................................................. 50 3.2 Diseño de la Investigación ..................................................................................... 51 3.2.1 Tipo de diseño de investigación. ....................................................................... 51 3.3 Población y muestra ............................................................................................... 51 5 3.3.1 Población ........................................................................................................... 51 3.3.2 Muestra .............................................................................................................. 52 3.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ................................................... 53 3.4.1 Técnicas utilizadas en la recolección de datos .................................................. 53 3.4.2 Instrumentos utilizados en la recolección de datos ........................................... 59 3.5 Técnica de tratamiento de datos ............................................................................. 61 3.5.1 Estadística descriptiva ....................................................................................... 61 CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................... 63 4.1 Resultados del tratamiento y análisis de la información ........................................ 63 4.1.1 Características morfométricas de células y tejidos de la hoja ........................... 63 4.1.2 Correlación de la morfometría de células y tejidos del mesófilo con la altitud 87 4.1.3 Correlación de la morfometría de células oclusivas de estomas con el número cromosómico ........................................................................................................ 101 4.2 Discusión de resultados ........................................................................................ 104 CONCLUSIONES ............................................................................................................. 109 RECOMENDACIONES ................................................................................................... 110 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 111 ANEXOS ........................................................................................................................... 122 6 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Polylepis incana Humboldt, Bonpland & Kunth, ................................................ 36 Figura 2. Polylepis rodolfo-vasquezii L. Valenzuela & I. Villalba...................................... 37 Figura 3. Morfología y tipos de movimientos en las células oclusivas de los estomas....... 40 Figura 4. Tipo de parénquima: A) Clorofiliano (Clorénquima) en empalizada; B) Cortical; C) Clorofiliano, lagunoso; D) Aerénquima. ................................................................. 43 Figura 5. Especiación simpátrica por autopoliploidía en la plantas. ................................... 45 Figura 6. Mecanismo de especiación alopoliploide en las plantas. ..................................... 45 Figura 7. Altura del árbol de donde se seleccionará la muestra. ......................................... 52 Figura 8. Selección de la muestra (Rama de aproximadamente 25 cm). ............................. 53 Figura 9. Bosque Dorado (Polylepis incana). ..................................................................... 54 Figura 10. Bosque Paucho (Polylepis rodolfo-vasquezii). .................................................. 55 Figura 11. Bosque Quilcaycocha (Polylepis rodolfo-vasquezii). ........................................ 56 Figura 12. Bosque Toldopampa (Polylepis rodolfo-vasquezii). ......................................... 56 Figura 13. Células oclusivas de estomas. A) P. incana, B) P. rodolfo-vasquezii. Abreviatura: Es: Estoma. ................................................................................................................... 63 Figura 14. Tamaño promedio de las células oclusivas de estomas (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ............................................................................................................. 64 Figura 15. Diferencias significativas para células oclusivas de estomas entre los bosques pertenecientes a P. incana y P. rodolfo-vasquezii. ...................................................... 66 Figura 16. Corte transversal de la hoja. A) P. incana, B) P. rodolfo-vasquezii. Abreviatura: Ead: Epidermis adaxial................................................................................................. 67 Figura 17. Tamaño promedio de la epidermis adaxial (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ................................................................................................................................. 68 Figura 18. Diferencias significativas para epidermis adaxial entre los bosques pertenecientes a la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. .............................................................. 70 Figura 19. Corte transversal de la hoja. A) P. incana, B) P. rodolfo-vasquezii. Abreviatura: Eab: Epidermis abaxial. ............................................................................................... 71 Figura 20. Tamaño promedio de la epidermis abaxial (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ................................................................................................................................. 71 7 Figura 21. Diferencias significativas para epidermis abaxial entre los bosques pertenecientes a la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. .............................................................. 74 Figura 22. Corte transversal de la hoja. A) P. incana, B) P. rodolfo-vasquezii. Abr.: Pe: Parénquima empalizada................................................................................................ 74 Figura 23. Tamaño promedio del parénquima empalizada (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ................................................................................................................. 75 Figura 24. Diferencias significativas para parénquima de empalizada entre los bosques de la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. .................................................................... 77 Figura 25. Tejido de parénquima esponjoso. A) P. incana, B) P. rodolfo-vasquezii. Abr.: Pes: Parénquima esponjoso. ......................................................................................... 78 Figura 26. Tamaño promedio del parénquima esponjoso (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ................................................................................................................. 78 Figura 27. Diferencias significativas para parénquima esponjoso entre los bosques pertenecientes a la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. ...................................... 81 Figura 28. Tamaño promedio del espesor de hoja (m) de los cuatro bosques de Polylepis sp. ................................................................................................................................. 82 Figura 29. Diferencias significativas para espesor de hoja entre los bosques pertenecientes a la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. .............................................................. 84 Figura 30. Promedio del área del hoja de los bosques de Polylepis sp. .............................. 84 Figura 31. Diferencias significativas para espesor de hoja entre los bosques pertenecientes a la especie P. incana y P. rodolfo-vasquezii. ................................................................ 87 Figura 32. Regresión lineal entre las variables tamaño de epidermis adaxial (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 90 Figura 33. Regresión lineal entre las variables tamaño de epidermis abaxial (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 92 Figura 34. Regresión lineal entre las variables tamaño del parénquima de empalizada (µm) y la altitud (msnm). ...................................................................................................... 94 Figura 35. Regresión lineal entre las variables tamaño parénquima esponjoso (µm) y la altitud (msnm). ............................................................................................................. 96 Figura 36. Regresión lineal entre las variables espesor de hoja (µm) y la altitud (msnm). 98 Figura 37. Regresión lineal entre las variables área de hoja (cm2) y la altitud (msnm). ... 100 8 Figura 38. Regresión lineal entre las variables tamaño de células oclusivas de estomas (µm) y el número de cromosomas (2n). .............................................................................. 104 9 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Ubicación de los Bosques del estudio ................................................................... 29 Tabla 2. Especies registradas según departamento en el Perú ............................................. 34 Tabla 3. Lista de especies de Polylepis, rangos altitudinales, distribución a nivel de departamentos............................................................................................................... 35 Tabla 4. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en la morfometría de células oclusivas de estomas. ............................................................. 64 Tabla 5. Análisis de ANOVA, para morfometría de células oclusivas de estomas. ........... 65 Tabla 6. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de morfometría de células oclusivas de estomas. ............................................... 65 Tabla 7. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en la morfometría de epidermis adaxial ................................................................................ 69 Tabla 8. Análisis de ANOVA, para morfometría de epidermis adaxial. ............................. 69 Tabla 9. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de morfometría de epidermis adaxial.................................................................. 70 Tabla 10. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en la morfometría de epidermis abaxial ................................................................................ 72 Tabla 11. Análisis de ANOVA, para morfometría de epidermis adaxial. ........................... 73 Tabla 12. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de morfometría de epidermis abaxial.................................................................. 73 Tabla 13. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, para morfometría de parénquima de empalizada ................................................................. 76 Tabla 14. Análisis de ANOVA, para para morfometría de parénquima de empalizada ..... 76 Tabla 15. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de morfometría de parénquima de empalizada ................................................... 77 Tabla 16. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en la morfometría de parénquima esponjoso ........................................................................ 79 Tabla 17. Análisis de ANOVA, para morfometría de parénquima esponjoso .................... 80 Tabla 18. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de morfometría de parénquima esponjoso .......................................................... 80 10 Tabla 19. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en el espesor de hoja ............................................................................................................. 82 Tabla 20. Análisis de ANOVA, para espesor de hoja ......................................................... 83 Tabla 21. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de espesor de hoja ............................................................................................... 83 Tabla 22. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov-Smirnov, en el área de hoja .......................................................................................................................... 85 Tabla 23. Análisis de ANOVA, para área de hoja............................................................... 86 Tabla 24. Datos del p-valor del Test de Duncan para la comparación entre bosques, en los datos de área de hoja .................................................................................................... 86 Tabla 25. Media de los valores medidos de células oclusivas de estomas y cromosomas para seis especies de Polylepis sp ........................................................................................ 88 Tabla 26. Análisis de correlación entre el tamaño de la epidermis adaxial (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 88 Tabla 27. Análisis de regresión entre el tamaño de la epidermis adaxial (µm) y la altitud (msnm) ......................................................................................................................... 89 Tabla 28. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el tamaño de epidermis adaxial (µm) y la altitud (msnm) .................................................................................. 89 Tabla 29. Análisis de correlación entre el tamaño de la epidermis abaxial (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 90 Tabla 30. Análisis de regresión entre el tamaño de la epidermis abaxial (µm) y la altitud (msnm) ......................................................................................................................... 91 Tabla 31. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el tamaño de epidermis adaxial (µm) y la altitud (msnm) .................................................................................. 91 Tabla 32. Análisis de correlación entre el tamaño de la epidermis abaxial (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 93 Tabla 33. Análisis de regresión entre el tamaño del parénquima de empalizada (µm) y la altitud (msnm) .............................................................................................................. 93 Tabla 34. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el tamaño del parénquima de empalizada (µm) y la altitud (msnm) .................................................. 94 Tabla 35. Análisis de correlación entre el tamaño del parénquima esponjoso (µm) y la altitud (msnm). ........................................................................................................................ 95 11 Tabla 36. Análisis de regresión entre el tamaño parénquima esponjoso (µm) y la altitud (msnm) ......................................................................................................................... 95 Tabla 37. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el tamaño del parénquima esponjoso (µm) y la altitud (msnm) ......................................................... 96 Tabla 38. Análisis de correlación entre el espesor de hoja (µm) y la altitud (msnm). ........ 97 Tabla 39. Análisis de regresión entre el espesor de hoja (µm) y la altitud (msnm) ............ 97 Tabla 40. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el espesor de hoja (μm) y la altitud (msnm). ...................................................................................................... 98 Tabla 41. Análisis de correlación entre el área de hoja (cm2) y la altitud (msnm).............. 99 Tabla 42. Análisis de regresión entre el área de hoja (cm2) y la altitud (msnm) ................. 99 Tabla 43. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el área de hoja (cm2) y la altitud (msnm). ....................................................................................................... 100 Tabla 44. Media de los valores medidos de células oclusivas de estomas y cromosomas para seis especies de Polylepis sp., y ploidía. .................................................................... 101 Tabla 45. Análisis de correlación entre el tamaño de las células oclusivas de estomas (µm) y el número cromosómico (2n). ................................................................................. 102 Tabla 46. Análisis de regresión entre el tamaño de células oclusivas de estomas (µm) y el número de cromosomas (2n). ..................................................................................... 102 Tabla 47. Análisis de ANOVA, para el análisis de la regresión entre el tamaño de células oclusivas de estomas (µm) y el número de cromosomas (2n). .................................. 103 12 RESUMEN Los bosques de Polylepis son considerados uno de los ecosistemas más vulnerables y amenazados. Su proceso evolutivo ha sido afectado por las alteraciones de la poliploidía obstaculizando estudios ecológicos y taxonómicos debido a la similar morfología de muchas especies del género amenazando la diversidad genética del bosque nativo de Polylepis a través del desplazamiento por competencia entre especies más poliploides que otras, y los cambios fisiológicos que generan en la anatomía foliar del mesófilo al adaptarse a ecosistemas con condiciones ambientales extremas (rango altitudinal). El objetivo del estudio fue conocer la relación existente entre las características morfométricas de la hoja de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana con la altitud y el número cromosómico en la región Junín, por lo cual se describieron las características de células y tejidos de la hoja perteneciente a las dos especies para posteriormente realizar un análisis de correlación con la altitud y el número cromosómico. La investigación tuvo un diseño descriptivo simple y correlacional - transeccional de tipo básico no experimental. Se colectaron muestras de 20 árboles de cuatro bosques. Los datos fueron obtenidos a partir de técnicas y protocolos biológicos para la observación y medición de tejidos y células. Se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en cada componente morfométrico de Polylepis incana y Polylepis rodolfo-vasquezii, incluso estas diferencias son notorias a nivel de poblaciones pertenecientes a una misma especie, pero a altitudes diferentes. La relación entre altitud y tamaño de las células y tejidos del mesófilo, muestran una moderada correlación, que se manifiesta en la variación del tamaño de las células y tejidos a partir de la variación de la altitud. La relación entre tamaño de estomas de células oclusivas y número cromosómico presentó una correlación muy baja negativa de r = -0.033; evidenciando la importancia de considerar el estudio de los factores ambientales como radiación, precipitación y estrés hídrico. Las diferencias morfométricas que se ven influenciadas por factores como altitud, muestran la capacidad de un individuo poliploide a adaptarse a condiciones ambientales extremas, como parte de su proceso evolutivo o de adaptación. Palabras claves: Polylepis incana, Polylepis rodolfo-vasquezii, morfometría, número cromosómico, células oclusivas de estomas, altitud. 13 ABSTRACT Polylepis forests are considered one of the most vulnerable and threatened ecosystems. Its evolutionary process has been affected by the effects of polyploidy hampering ecological and taxonomic studies due to the similar morphology of many species of the genus, threatening the genetic diversity of the native forest of Polylepis through the displacement by competition between more polyploid species than others, and the physiological changes that they generate in the foliar anatomy of the mesophile when adapting to ecosystems with extreme environmental conditions (altitudinal range). The objective of the study was to know the relationship between the morphometric characteristics of Polylepis rodolfo-vasquezii and Polylepis incana leaf with the altitude and the chromosome number in the Junín region, for which the characteristics of the cells and tissues of the leaf belonging to the two species to later perform a correlation analysis with altitude and chromosome number. The research had a simple descriptive and correlational - transectional design of a non-experimental type. 20 samples from four forests were collected. The data were obtained from biological techniques and protocols for the observation and measurement of tissues and cells. Significant statistical differences were obtained in each morphometric component of Polylepis incana and Polylepis rodolfo-vasquezii; even these differences are notorious at the level of populations belonging to the same species, but at different altitudes. The relationship between the altitude and the size of mesophyll cells and tissues show a moderate correlation, which is manifested in the variation of the size of cells and tissues from the variation in altitude. The relationship between the size of occlusive cell stomata and the chromosome number showed a very low negative correlation of r = -0.033; evidencing the importance of considering the study of environmental factors such as radiation, precipitation and water stress. The morphometric differences that are influenced by factors such as altitude show the ability of a polyploid individual to adapt to extreme environmental conditions, as part of their evolutionary or adaptation process. Keywords: Polylepis incana, Polylepis rodolfo-vasquezii, morphometry, chromosome number, stoma occlusive cells, altitude. 14 INTRODUCCIÓN Los Andes tropicales presentan una gran biodiversidad y un alto nivel de endemismo (1; 2; 3), siendo considerado una de las principales prioridades de conservación mundial al ser reconocidos como ‘hotspots’ de biodiversidad global (4). Dentro de esta región, se encuentran ecosistemas importantes, tales como los bosques de Polylepis los cuales se encuentran amenazados (5; 6). El género Polylepis pertenece a la familia Rosaceae. Su distribución es a lo largo de los Andes, en un rango altitudinal desde 3.500 hasta 5.000 msnm; este género consta de aproximadamente 28 especies que ocupan diversos hábitats, desde bosques de neblina hasta los volcanes áridos del Altiplano (7). Los bosques de Polylepis regulan la temperatura permitiendo el desarrollo de una gran diversidad de flora y fauna, mucha de ella endémica convirtiéndose en un sistema biológico singular de los Andes (8; 7; 9). Sin embargo, durante los últimos siglos estos bosques han sufrido daños por actividades humanas, como la tala para leña, quema con fines de pastoreo y establecimiento de áreas de cultivos, causando la destrucción de más del 95 % de su distribución original (7). Encontrándose a 14 especies categorizadas en entado vulnerable (10). Un aspecto negativo y trascendental de la hibridación es que causa un efecto de competencia en las especies más poliploides convirtiéndolas en plantas invasoras y ocasionando el desplazamiento de las especies nativas de Polylepis, si no se establecen parámetros para su uso y control podrían con el tiempo ocasionar la disminución de bosques de otras especies (11). En este contexto, el objetivo de la investigación fue describir las características morfométricas de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana y correlacionarlas con la altitud para conocer los cambios fisiológicos ocasionados por la adaptación a ecosistemas con condiciones ambientales más extremas (rango altitudinal) y con el número 15 cromosómico, para obtener información sobre indicios de ploidía en estas especies, a través de la relación tamaño de células oclusivas-número cromosómico. La investigación se divide en 4 capítulos, en el capítulo I se detalla el planteamiento y formulación del problema, los objetivos, justificación e importancia y descripción de las variables. La dificultad limitante es la poca información sobre estudios de morfometría, anatomía foliar y citogenética en especies de Polylepis en Junín y su influencia por factores abióticos de su entorno, todo ello muy importante para la toma de decisiones en temas de conservación de bosques montanos nativos específicamente en la reforestación con especies nativas de Polylepis. El capítulo II comprende el marco teórico, antecedentes de la investigación, bases teóricas, metodologías existentes, técnicas e instrumentos de investigación y definición de términos básicos. El método de medición, estuvo basado en la toma de medidas longitudinales (µm) de células y tejidos pertenecientes al mesófilo del foliolo como: Células guardianas de estomas, área de la hoja, espesor de hoja, epidermis adaxial y abaxial, parénquima de empalizada y esponjoso pertenecientes al Bosque Dorado, Bosque Toldopampa, Bosque Quilcaycocha y Bosque Paucho. En el capítulo III, se describe la metodología y el alcance de la investigación, diseño de la misma, población y muestra, técnicas e instrumentos de recolección de datos. El estudio es básico, descriptivo-correlacional no experimental, con tres variables y tres dimensiones. En el capítulo IV, se describen los resultados y se desarrolla la discusión de los mismos a través de resultados del análisis estadístico de cada componente estudiado y la comparación con estudios relacionados al estudio. El presente estudio es parte del proyecto “Estudio citogenético y molecular de la diversidad genética y estructura poblacional de bosques de Polylepis sp., con fines de conservación en la región Junín”, el cual se viene desarrollando en las instalaciones de la Universidad Continental en convenio y con fondos del Estado a través del Fondo para Ciencia y Tecnología del CONCYTEC. 16 CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO 1.1 Planteamiento y formulación del problema 1.1.1 Planteamiento del problema Los bosques son los ecosistemas terrestres más extensos, ocupando el 30 % de la superficie emergida del planeta (FAO, 2007). A esta importancia espacial se añade su enorme valor en términos de biodiversidad, asociada especialmente a los bosques tropicales. Además, representan el hábitat de más del 80 % de la biodiversidad terrestre del planeta, ayudan a la protección de las cuencas hidrográficas, regulan el ciclo hidrológico y abastece de agua limpia a gran parte del mundo (12). Los Andes tropicales representan una parte del mundo con gran cantidad de diversidad de hábitats (14). Su extensión original de vegetación primaria fue de 1 258 000 km2, del cual solo queda el 25 % de su extensión, esta región además de albergar 45 000 especies de plantas, cuenta con gran porcentaje de endemismo en especies de aves, reptiles, mamíferos y anfibios siendo considerados como uno de los “Hotspots” de biodiversidad global con prioridad de conservación a nivel mundial (4). 17 Otros tipos de bosques, considerados como muy amenazados, son aquellos pertenecientes al género Polylepis (6). Estos representan gran parte la vegetación natural de los Andes centrales a 3.500 msnm y 4.400 msnm, estos han ido ocupando gran variedad de hábitats, que van desde bosques de neblina hasta los volcanes áridos (7), y contienen una diversidad de fauna y flora única con altos niveles de endemismo. Desafortunadamente, éstos bosques también representan uno de los hábitats más vulnerables por la destrucción de estos a causa del sobrepastoreo y el uso de sus árboles como producto maderable (15). Como consecuencia de estas actividades que iniciaron hace miles de años y que se intensificó desde la Conquista, se calcula que el 95 % de los bosques de Polylepis que se encontraban en el Perú desaparecieron y se estima que quedan menos del 10 % de su extensión original en las regiones altas de Bolivia y Perú (16) encontrándose a catorce especies listados como vulnerables (5) y en Perú según el D.S 043-2006- AG, los bosques de Polylepis están considerados en peligro de extinción estando registradas 14 de las 28 especies conocidas (10). En la vida vegetal el factor “poliploidía” es formado a partir de un progenitor diploide y su presencia es más frecuente en altas latitudes y altitudes (20; 21). Este representa una importante fuerza y proceso evolutivo, tal que cerca del 70 % de las plantas tienen un origen poliploide (20), además puede haber influenciado directamente al incremento en el número de especies de plantas a través de eventos de duplicación ancestrales a partir del Cretácico temprano (23; 25). Ventajas y desventajas evolutivas potenciales de la poliploidización han sido propuestas, sin embargo estas se reducen al enfrentamiento de una competencia directa con su progenitor diploide, y sólo sobrevivirá lo suficiente adaptándose a un nuevo nicho o desplazando a la especie diploide parental (27; 29; 31). Si bien es cierto este proceso natural provoca la adaptación de especies a nuevos hábitats, también trae consigo problemas que pueden llegar a ser muy significativas como en el género Polylepis que normalmente se ha clasificado e identificado a través de la descripción de sus caracteres morfológicos; pero a causa de la hibridación, poliploidía y características morfológicos similares se ha tornado complicado la clasificación taxonómica a nivel de especies (11; 12; 30), además de obstaculizar 18 estudios ecológicos y biogeográficos debido a la semejanza morfológica de muchas especies del género, incluso aun si se encuentren en ubicaciones geográficas distintas y posean diferencias a nivel genético (27). Asimismo, este proceso amenaza la diversidad genética del bosque nativo de Polylepis a través del efecto de desplazamiento por competencia entre especies o el surgimiento de híbridos que se producen al reforestar bosques nativos con especies diferentes, y que los procesos que ocurren a nivel interespecífico pueden agravar la tasa de reducción poblacional debido a la presencia de citotipos incompatibles (21; 22), además que la poliploidía usualmente genera un aumento del tamaño celular el cual tiene la propiedad de generar plantas más vigorosas, pero con un impacto negativo en la fertilidad (29). Sin embargo, el estudio morfométrico de las células oclusivas de los estomas permitió adquirir información sobre índices del nivel de ploidía correlacionando variables morfométricas con el número cromosómico (30), debido a que el tamaño de las células está estrechamente vinculado con la cantidad de ADN y el número cromosómico por lo que el estudio de células guardianas de estomas permite estimar los niveles de ploidía a través del tamaño de estos (25; 26). Asimismo, se hicieron estudios sobre la respuesta de adaptación a su entorno y los efectos en la fisiología del Polylepis, algunos de los rasgos varían con relación a la altitud, como el espesor de las hojas y el área foliar (33). Esta respuesta de adaptación está estrechamente influenciada por el grado de ploidía de cada especie. En la región Junín se tiene registro de 7 especies de Polylepis de las cuales la especie Polylepis rodolfo-vasquezzi fue descubierta hace menos de 3 años. Esta especie y las otras 6 presentan poca o nada de información respecto a sus características morfométricas, citogenéticas y su relación y adaptación con el ambiente (fisiológicas). Por estas razones, este estudio tiene como objetivo describir las características morfométricas de las especies Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana y realizar un análisis de correlación con factores citogenéticos, como el número cromosómico para poder determinar indicios de poliploidía de las especies. Además, 19 realizar un análisis de correlación con la altitud para poder observar los cambios fisiológicos a nivel de poblaciones e intra poblacional. Finalmente, es importante mencionar que las características morfométricas son muy importantes en la biología, porque permiten obtener descripciones cuantitativas de organismos a nivel de células y tejidos (34). 1.1.2 Formulación del problema 1.1.2.1 Problema general ¿Qué relación existe entre las características morfométricas de la hoja de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana con la altitud y el número cromosómico en la región Junín, 2017? 1.1.2.2 Problemas específicos  ¿Cuáles son las características morfométricas de las células oclusivas de los estomas, epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana presentes en la Región Junín, 2017?  ¿Cuál es la relación del tamaño de la epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada con la altitud de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana presentes en la Región Junín, 2017?  ¿Cuál es la relación de la longitud de las células oclusivas de los estomas con el número cromosómico de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana presentes en la Región Junín, 2017? 1.2 Objetivos 1.2.1 Objetivo general Describir las características morfométricas de la hoja de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana y su relación con la altitud y el número cromosómico en la Región Junín, 2017. 1.2.2 Objetivos específicos 20  Describir las características morfométricas de las células oclusivas de las estomas, epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana en la Región Junín, 2017.  Determinar la relación del tamaño de la epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada con la altitud de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana en la Región Junín, 2017.  Determinar la relación de longitud de las células oclusivas de los estomas con el número cromosómico de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana en la Región Junín, 2017. 1.3 Justificación e importancia Científica Este género se encuentra en peligro de extinción (10), su distribución fue decreciendo por las actividades antropogénicas e inserción de otras especies que muestran una mayor adaptabilidad (6). Como consecuencia de ello, la disminución de bosques endémicos se ha reducido en un 95 % de su extensión original (16). En la región Junín se ha descubierto recientemente una nueva especie en el Área Natural Protegida Pui-Pui (35), siendo esta denominada Polylepis rodolfo-vasquezzi. Esta especie al ser recientemente descubierta su situación requiere de estudios que permitan brindar información de los beneficios ambientales que provee, su adaptabilidad al medio, características genéticas e información descriptiva, todo ello para prevenir la disminución de los bosques remanentes y poder conservar estos bosques dentro y fuera de la región Junín. Metodológica La metodología aplicada estuvo basada en selección de muestras con caracteres específicos y no aleatorios. Se utilizó este método debido a que permite obtener datos de mayor confiabilidad, en este tipo de estudios es necesario seleccionar muestras biológicas con características fitosanitarias óptimas, que no sean clones debido a que el factor citogenético 21 varía en función a cada individuo. Asimismo, esta metodología es usualmente usada para estudios citogenéticos. Práctica El estudio se dirige a proporcionar nueva información científica descriptiva sobre características morfométricas de células y tejidos del mesófilo de la hoja e información correlacional entre éstas variables con la altitud y el número cromosómico, que en conjunto proporcionarán nuevos datos sobre citogenética, anatomía vegetal y la situación de adaptabilidad al medio de estas especies que mantienen gran importancia e impacto en resolver vacíos sobre el desplazamiento por competencia entre especies, generación de híbridos y citotipos incompatibles pueden agravar la tasa de reducción poblacional por efectos de poliploidia, apoyada a factores naturales y antropogénicos. Asimismo, la información generada permitirá proponer estrategias que al aplicarse contribuirían a comprender y resolver el problema de pérdida de bosques nativos de alta montaña y sobre todo lo beneficios ambientales que estos generan. Hipótesis y descripción de variables 1.3.1 Hipótesis General Las características morfométricas de las hojas de Polylepis rodolfo-vasquezii serán diferentes a Polylepis incana. Existe una alta correlación entre las características morfométricas de la hoja con la altitud y el número cromosómico. 1.3.2 Hipótesis Específicas Ho: Las características morfométricas de las células oclusivas de estomas, epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada de Polylepis rodolfo-vasquezii serán iguales a Polylepis incana. 22 H1: Las características morfométricas de las células oclusivas de estomas, epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada de Polylepis rodolfo-vasquezii serán diferentes a Polylepis incana. Ho: La relación del tamaño de la epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada con la altitud de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana será menor que 0.7 H1: La relación del tamaño de la epidermis adaxial y abaxial, espesor de hoja, área de hoja, parénquima esponjoso y empalizada con la altitud de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana será mayor que 0.7 Ho: La relación de la longitud de las células oclusivas de los estomas con el número cromosómico de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana será menor que 0.7. H1: La relación de la longitud de las células oclusivas de los estomas con el número cromosómico de los bosques de Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana será mayor que 0.7. 1.4 Descripción de variables 1.4.1 Variables  Especies de Polylepis  Características morfométricas de la hoja  Número cromosómico de las especies de Polylepis sp.  Altitud de los bosques 23 1.4.2 Operacionalización Fuente: Elaboración propia Variables Tipos de variable Definición operacional Categorías o Dimensiones Definición conceptual Indicador Características morfométricas Dependiente Descripción métrica de las de las células o tejidos que se encuentran dentro de la hoja de cada especie de Polylepis sp. Medidas microscópica s de las células y tejidos de la hoja. Es la caracterización cuantitativa del tamaño, se puede utilizar para cuantificar un carácter de significancia evolutiva, y para detectar los cambios en la forma. -Longitud de células oclusivas de estomas. -Longitud de epidermis adaxial y abaxial. -Espesor de hoja. -Área de hoja -Longitud de parénquima esponjoso y empalizada. Altitud Independiente Altura con respecto al nivel del mar del bosque de Polylepis sp. Distancia vertical Distancia vertical que existe entre un punto de la tierra y el nivel del mar. Altura (msnm) Número cromosómico Es el número específico promedio de cromosomas característico de cada especie de Polylepis sp,. Juego de cromosomas Es el conjunto de juegos de cromosomas siendo n en los gametos y 2n en las células vegetativas de una especie diploide. Número diploide de cromosomas (2n) 24 CAPITULO II MARCO TEÓRICO 2.1 Antecedentes de la investigación. En el artículo científico titulado: “An Andean radiation: Polyploidy in the tree genus Polylepis (Rosaceae, Sanguisorbeae)”, cuyo objetivo fue deducir los niveles de ploidía de las especies de Polylepis a través de estudios de conteo de cromosomas, medidas de células y análisis de citometría de flujo. En este estudio se identificó la presencia de poliploidía y se dedujo niveles de ploidía para la mayoría de las especies en el género. Asimismo, se encontró que los niveles de ploidía mostraron una progresión clara de dipolidía a poliploidía, ello indica que la poliploidización pudo haber jugado un papel principal en los procesos de especiación y en la colonización de nuevos hábitats. Este trabajo aporta a esta investigación al establecer una metodología indirecta de estimación de presencia y niveles de ploidía en especies del género Polylepis, metodología que permitirá aplicarlos para otras especies las cuales no se estudiaron aún (27) como en Polylepis rodolfo-vasquezii. El artículo científico que tiene como título “Estudio Citogenético de las especies del género Polylepis (P. incana y P. racemosa) en el Ecuador”, tuvo como objetivo identificar las características citogenéticas de las especies P. incana y P. racemosa a través del conteo de cromosomas. En el estudio, se obtuvo que no existe alta variación en los números 25 cromosómicos entre individuos de la misma población pertenecientes a la especie P. incana (Illinizas 2n = 37–42), ello indica que en dichas poblaciones no se está generando una respuesta adaptativa al medio. Sin embargo, si existe una alta variación en el caso de P. racemosa que sugiere la presencia de individuos poliploides intraespecíficos y su alta respuesta adaptativa al medio. Este estudio aporta nuevo conocimiento sobre el número promedio de cromosomas y presencia de poliploidía para las especies P. incana considerando que los estudios de conteo cromosómico para este género son complicados debido al diminuto tamaño de los cromosomas que presentan (26), asimismo ayuda como referencia para la comparación con P. incana de Junín. El artículo científico titulado: “Chromosomal and morphological studies of diploid and polyploid cytotypes of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni (Eupatorieae, Asteraceae)”, cuyo objetivo fue examinar el número de cromosomas y algunas características morfológicas de las cepas de Stevia rebaudiana. Se obtuvo que todas las cepas tenían 2n = 22, excepto dos, que tenían 2n = 33 y 2n = 44. Además, todas las cepas tenían polen inviable. Por lo que se deduce que, cuanto mayor sea el número de ploidía, mayor será el tamaño del polen y los estomas, y menor será su número por unidad de área. El estudio aporta información contrastando la afirmación de que cuanto mayor sea el número cromosómico (mayor ploidía) y mayor las dimensiones del tamaño de las células vegetales (102). El artículo titulado: “Citogeografía de cuatro especies de Polylepis (Rosaceae) en el Ecuador: Información relevante para el manejo y conservación de los bosques andinos”, tuvo como objetivo “Identificar las características citogeográficas de las especies de 4 especies de Polylepis”. A través de conteos cromosómicos y georeferenciación de puntos de colección de los individuos con diferencias cromosómicas y rango de distribución. En la investigación se identificaron varios citotipos principalmente hexaploides, octoploides, y decaploides. Los resultados confirman la compleja historia de este género y la importancia de la poliploidía en su evolución y la amplia distribución de los poliploides que pueden generarse por el contacto secundario entre poblaciones naturales y translocadas. El estudio aporta información sobre la influencia del rango de distribución en los números cromosómicos, además de que advierte que estos efectos genéticos alteran la estabilidad de bosques endémicos, que son invadidos por especies no endémicas (28). 26 El artículo científico titulado: “Anatomía Foliar de Polylepis sericea Wedd. (Rosaceae) a dos altitudes en los Altos andes venezolanos”, tuvo como objetivo estudiar la anatomía foliar de individuos de Polylepis sericea (Rosaceae) a dos altitudes contrastantes Loma Redonda a 4 100 msnm y en el páramo de Mucubaji a 3 500 msnm y conocer la estructura y determinar la existencia de caracteres disimiles generados por las diferencias altitudinales. Se encontró que la existencia de caracteres disimiles estructurales dados en primer lugar por el efecto altitudinal fueron la reducción del área foliar y el aumento de tejido clorofílico, además de diferencias derivadas del efecto hídrico estacional como engrosamiento cuticular y diferencias en la densidad estomática. Este estudio aporta relevante información que muestra que los factores ambientales como la altitud a la que crecen estas especie arbóreas, influyen en la estructura de la anatomía de la hoja aun perteneciendo a una misma especie (37). El artículo científico que titula: “Viabilidad de polen, densidad y tamaño de estomas en autotetraploides y diploides de Physalis Ixocarpa”, cuyo objetivo fue estudiar el impacto de la autopoliploidía en la viabilidad de polen y el tamaño y frecuencia estomática del tomate de cáscara (Physalis ixocarpa) analizando el polen, tamaño y número de estomas de poblaciones diploides y autotetraploides. La investigación muestra que los individuos diploides tuvieron valores de viabilidad de polen y densidad estomática, significativamente mayores que los autotetraploides; sin embargo, los diploides tuvieron granos de polen y estomas significativamente más pequeños que los autotetraploides. Por lo que la poliploidía afectó la viabilidad del polen que ocasiona pérdida de fertilidad, además el aumento del tamaño celular muestra que los autopoliploides tienen el potencial de generar plantas más vigorosas, pero con una disminución en la fertilidad, aunque esta característica puede mejorarse al paso de varias generaciones. El estudio aporta conocimiento estableciendo que los individuos poliploides y diploides muestran características físicas diferentes como mayor tamaño pero con una reducción en la cantidad de células, evidenciando una relación inversa entre tamaño del individuo y cantidad de células (29). En la tesis titulada: “Determinación del número cromosómico de Polylepis pauta y Polylepis serícea presentes en la provincia de Pichincha”, estudiadas en poblaciones del Parque Nacional Cayambe Coca, Reserva Mojanda y Reserva Yanacocha en la provincia 27 de Pichincha - Ecuador. El estudio aporta nueva información sobre el número de conteo de cromosomas para las especies P. pauta y P. sericea. Siendo sus principales conclusiones:  Descripción del número cromosómico exacto con un valor de 2n = 72 para P. pauta en las poblaciones de Mojanda y Cayambe Coca y otro para P. sericea en la que se obtuvo un valor de 2n = 82 en la población de Yanacocha.  Que los conteos cromosómicos directos permiten diferenciar especies morfológicamente similares como es el caso de P. pauta y P. sericea y descifrar sus niveles de ploidía.  Evidencia de un nivel de ploidía decaploide (2n = 10x) para P. pauta y dodecaploide (2n = 12x) para P. sericea en base al número cromosómico x = 7 de la familia Rosaceae (38). En la tesis titulada: “Morfología y fisiología de tres especies de Polylepis microphylla (Wedd.), P. racemosa y P. subsericans (Rosaceae) en tres niveles altitudinales, en Yanacocha, Urubamba - Cusco”. Desarrollado en Cusco – Perú. El estudio aporta nueva información sobre características morfológicas y fisiológicas de 3 especies de Polylepis sp., en tres niveles altitudinales diferentes. Siendo sus principales conclusiones:  La existencia de diferencias en las características morfológicas y fisiológicas en las especies Polylepis microphylla (Wedd.) Bitter, Polylepis racemosa Ruiz & Pav. y Polylepis subsericans J.F. Macbr.  Que las tres especies de Polylepis presentan diferencias en el número de hojas y foliolos, área foliar específica, espesor de la hoja, largo de células del parénquima clorofiliano, densidad estomática, densidad y forma de tricomas, espesor del ritidoma, altura de árbol, diámetro a la altura del pecho, contenido hídrico, contenido hídrico relativo, déficit de saturación hídrica y medidas de fluorescencia (39). En la tesis titulada: “Estudio del crecimiento de Polylepis sericea Wedd., en el páramo venezolano”, desarrollado en la Sierra Nevada de Mérida - Venezuela. El estudio aporta nueva información sobre las implicancias que se presentan en la etapa de desarrollo de la especie P. sericea en dos lugares del páramo. Siendo sus principales conclusiones:  En la localidad de Mucubají donde las condiciones ambientales son más favorable con respecto a Loma Redonda, Polylepis sericea presenta un mayor crecimiento y 28 una mayor asimilación de CO2, por lo que se espera que el balance de carbono sea mayor en Loma Redonda, este trabajo parece indicar que las diferencias en el crecimiento entre una y otra localidad es la toma de carbono y el efecto que ejerce la temperatura sobre los procesos fotosintéticos, y por lo tanto sobre el balance de carbono, más que sobre el crecimiento a nivel celular.  La estacionalidad hídrica representa un factor de estrés importante para Polylepis sericea, produciendo un efecto sobre la conductancia estomática que afecta la asimilación de CO2 y por tanto el crecimiento, el cual se ve reducido para la estación más desfavorable.  Los mecanismos adaptativos bien particulares de P. sericea discutidos por otros autores, este trabajo muestra que P. sericea posee mecanismos de adaptación que le permiten el establecimiento en un ambiente desfavorable, como con una adaptación en la maquinaria fotosintética durante ambas estaciones hídricas y cambios en la estructura anatómica que le permiten ser una especie exitosa en la conquista del `treeline´ (40). El artículo titulado: “Bosques de Polylepis”, describe la situación ambiental de los bosques de Polylepis y el efecto de la interrelación con las actividades de las poblaciones aledañas. En sus conclusiones explica que más de la mitad de las especies de plantas es utilizada por los habitantes locales, aunque muchas de éstas están en peligro de extinción debido a la destrucción de su hábitat. La conservación y restauración de bosques de Polylepis como parte de un cambio general de los métodos de uso de tierra de los Andes son imprescindibles para mantener la viabilidad ecosistémica de esta región tan densamente poblada(7). El artículo titulado: “A revision of the Genus Polylepis (Rosaceae: Sanguisorbeae)”, menciona que algunas especies de Polylepis forman bosques que crecen muy por encima de la línea normal de árboles a elevaciones superiores a los 5000 m. En consecuencia, Polylepis parece ser el género de angiospermas arborescentes de mayor naturalidad presente en el mundo y que la hibridación parece ocurrir entre las especies que dificultan la circunscripción de algunos taxones. Los datos de estas fuentes indican que se debe considerar que Polylepis consta de 15 especies, una de las cuales se describe primero en 29 este tratamiento. Se proporciona una clave para la identificación de las especies. Cada especie es ilustrada, discutida, y su distribución moderna mapeada (41). 2.2 Bases teóricas 2.2.1 Descripción del área de estudio El estudio se realizó en 4 bosques de la Región Junín, ubicados en zonas altoandinas, estos bosques están ubicados por encima de los 3.600 msnm llegando y superando los 4.300 msnm Tabla 1. Ubicación de los bosques del estudio PROVINCIA LOCALIDAD BOSQUE LOCALIZACIO N ALTITUD EXTENSIÓN UTM 18L Concepción Pomamanta Paucho 483929 8704028 4263 4.71 ha Concepción Quilcaycocha 483157 8704468 4362 3.1 ha Satipo Toldopampa Toldopampa 511714 8728273 4046 8.82 ha Huancayo Paccha Dorado 478635 8674931 3752 24.6 ha Fuente: Elaboración propia El interior de los bosques de Polylepis es muy húmedo, a causa de las bajas temperaturas. Su extensión se ha reducido durante las últimas décadas y ahora solo sobreviven en forma de relictos (42). Las variables climáticas de los bosques del estudio se muestran a continuación: Tabla 2. Variables climáticas de los bosques del estudio BOSQUE TEMPERATURA MEDIA ANUAL (°C) PRECIPITACIÓN ANUAL (mm/año) Dorado 8.4 657 Toldopampa 5.9 1753 Paucho 5.2 1266 Quilcaycocha 5.1 1254 Fuente: Extraído de (43) 2.2.1.1 Zonas de vida Las zonas de vida son determinadas en función a características de biotemperatura, precipitación, altura, entre otros. 30 Los bosques de Polylepis en la región Junín ocupan las zonas de vida Bosque húmedo, Bosque pluvial, Bosque muy húmedo, Páramo muy húmedo; en los pisos altitudinales Subalpino y Montano; y las regiones latitudinales Tropical y Subtropical (43). Tabla 3. Zonas de vida de los bosques del estudio Bosque Zonas de vida Dorado Bosque húmedo montano tropical Esta zona de vida es muy particular de algunas zonas altoandinas de la sierra de Tarma, Chanchamayo, Junín, Concepción y Huancayo. Abarca un área 397606.48 ha y representa el 08.9 % de la superficie total del departamento. Paucho Bosque muy húmedo montano tropical Esta zona de vida se encuentra presente en las provincias de Jauja, Concepción y Huancayo, y los límites occidentales de la provincia de Satipo. Abarca un área 136,500 ha y representa el 03.1 % de la superficie total del departamento Quilcaycocha Páramo muy húmedo subalpino tropical Este tipo de zona de vida caracteriza la mayor parte de la sierra del departamento de Junín. Cubre las zonas altoandinas de las provincias de Yauli, Junín y Huancayo. Abarca un área de 5, 276, 407,619 ha y representa el 11.68 % de la superficie total del departamento. Toldopampa Bosque pluvial montano tropical Se encuentra en las laderas cubiertas por bosques de neblina, y está presente principalmente en las provincias de Chanchamayo, Jauja, Concepción y Satipo. Cubre un área 56399 ha y 31 Fuente: Extraído de (43) Mapa de ubicación de los bosques del estudio Fuente: Elaboración propia. 2.2.2 Fundamentos teóricos 2.2.2.1 Género Polylepis representa 1.3 % de la superficie total del departamento. 32 La familia Rosaceae consta aproximadamente de 100 géneros y 3000 especies, está dividida en 4 subfamilias (36; 37), del cual la tribu Sanguisorbeae que se caracteriza por una polinización anemófila y frutos secos (7) y se constituye 14 géneros que están distribuidos casi en todos los continentes, pero en el hemisferio sur es en donde se concentra la mayor diversidad, como el género Polylepis (39; 8). Los bosques de Polylepis no se muestran homogéneos, a veces presentan mezclas de árboles de dos especies o se acompañan con otras especies (47). Se estima que la remanencia de los bosques representa menos del 10 % de su extensión original en el Perú y Bolivia (16), además de que 14 especies están listados como vulnerables (5). Los análisis filogenéticos sugieren que Polylepis se desarrolló a través del proceso de poliploidía desde el género Acaena (48) y que sus especies filogenéticamente basales eran árboles con hojas delgadas, 7-11 foliolos por hoja, corteza delgada e inflorescencias con abundantes flores (hasta más de 70) (9; 41; 42). La sucesiva evolución fue en dirección a especies con hojas más gruesas, menos número de foliolos, formación de una corteza más gruesa e inflorescencias reducidas con pocas flores. Estas adaptaciones se dieron por los hábitats fríos y áridos de los altos Andes al que estuvieron expuestos. La baja diferenciación genética de las especies sugiere que la evolución de este género ocurrió en los pocos últimos millones de años (9; 44; 42; 43). Los bosques formados por especies del género Polylepis representan hábitats naturales de variedad e importancia para otros seres vivos (7). Además, son considerados como uno de los ecosistemas forestales más amenazados del mundo (51). Se considera como bosque natural a los que se encuentren desde 3 700 hasta 4 200 msnm (12; 45; 46). 2.2.2.2 Taxonomía Este género está compuesto por 27 especies (8); (54), del cual en los andes peruanos se tiene registro del 70 % (19 especies), seguido de Bolivia que 33 cuenta con el 40 % y Ecuador el 25 % del total de especies. El resto de países en donde se desarrolla este género está representado por el 14 % a 3 %. 2.2.2.3 Ecología de los bosques de Polylepis Las condiciones ecológicas de los bosques están en relación a condiciones de temperatura, humedad y suelos. Debido a su localización a grandes elevaciones en los Andes, los bosques sufren amplias fluctuaciones diurnas de temperatura, con diferencias de 20 - 30°C, lo que representa un estrés enorme para las plantas. El crecimiento vegetativo del Polylepis tiene lugar sobre todo en la época húmeda y relativamente caliente (52; 53). 2.2.2.4 Distribución y conservación La distribución actual de los bosques de Polylepis es muy local. Existen algunas zonas con bosques relativamente extensos como en la Cordillera Blanca ubicado en el Perú, sin embargo, la gran mayoría de los bosques son pequeños restringidos a laderas rocosas y quebradas. Hasta hace poco tiempo, este patrón de distribución era considerado como natural, interpretándose a laderas rocosas y quebradas como microhábitats favorables para su desarrollo (54; 55; 56; 35; 9) Sin embargo, recientes estudios explican esta distribución es en realidad el resultado de miles de años de actividades humanas en los altos Andes (60). La quema frecuente de pastizales, que se efectúa para la mejora de pastizales, reduce la cobertura boscosa. Aunque los árboles maduros de Polylepis logren sobrevivir a las quemas de los pastos que crecen debajo, este no sucede lo mismo con las plántulas y árboles juveniles, los cuales mueren. Ello genera que la regeneración de los bosques esté restringida y con el tiempo los bosques desaparezcan (61). La extracción de leña para diferentes actividades incidió en la destrucción de los bosques de Polylepis, y como resultado de este proceso, se calcula que un 95 % de los bosques de Polylepis han desaparecido en el Perú (16). Como consecuencia de la destrucción de la gran mayoría de los bosques de Polylepis, es difícil establecer con certeza 34 su distribución natural potencial y los factores ecológicos que los determinan (43; 49; 50). 2.2.2.5 Especies de Polylepis de la región Junín La riqueza de especies de Polylepis a nivel nacional lo encabeza la región Cuzqueña, seguido por Ayacucho, Ancash, Lima y la región Junín que cuenta solo con 6 especies cada uno. Tabla 4. Especies registradas según departamentos en Perú Departamentos Número de especies registradas Cusco 10 Ayacucho 8 Ancash 6 Junín 6 Lima 6 Apurímac 5 Puno 4 Arequipa 3 Cajamarca 3 La Libertad 3 Tacna 3 Huánuco 2 Huancavelica 2 Lambayeque 2 Moquegua 2 Pasco 2 San Martin 2 Amazonas 1 Piura 1 Fuente: Extraído de (8) Las variaciones en los registros del número de especies de Polylepis para el Perú, se debe principalmente al limitado trabajo de campo que realizaron los 35 investigadores, quienes exploraron áreas restringidas de los Andes peruanos y basaron sus estudios principalmente en la revisión de especímenes, que se hallaban en los herbarios; además muchas especies sufrieron cambios en su estatus en los diferentes tratamientos (64). Tabla 5. Lista de especies de Polylepis, rangos altitudinales, distribución a nivel de departamentos. Especies Altitud (msnm) Departamento Polylepis canoi W. Mendoza 3350 - 3400 AY, CU, JU Polylepis flavipila (Bitter) M. Kessler & Schmidt-Leb. 3650 - 4100 HV, LI Polylepis incana Humboldt, Bonpland & Kunth 3000 - 4200 AN, AP, AY, CU, HU, JU, LI, PA, PU Polylepis incarum (Bitter) M. Kessler & Schmidt-Leb. 3100 - 4200 CU, PU Polylepis lanata (Kuntze) M. Kessler & Schmidt-Leb. 2900 - 4100 AP, AY, CU Polylepis microphylla (Wedd.) Bitter 3200 - 4000 AR, CU, LI Polylepis multijuga Pilger 2200 - 3600 AM, CA, LA Polylepis pauta Hieron. 1800 - 4000 AY, CU, JU, SM Polylepis pepei B.B. Simpson 3900 - 4500 AN, CU, PU, SM Polylepis racemosa Ruiz & Pav. 2900 - 4000 AN, AP, AY, CA, CU, HU, JU, LI, LL, PA Polylepis reticulata Hieron. 3350 - 4450 AN, JU, LI, LL Polylepis rugulosa Bitter 3000 - 4600 AR, MO, TA Polylepis sericea Wedd. 2000 - 4100 AN, CU, JU, LL Polylepis subsericans J.F. Macbride 2900 - 5100 AP, AY, CU Polylepis subtusalbida (Bitter) M. Kessler & Schmidt- Leb. 3000 - 4500 MO, TA Polylepis tarapacana Philippi 4200 - 4800 TA Polylepis tomentella Weddell 3500 - 4500 AP, AR, AY Polylepis triacontandra Bitter 3500 - 3900 PU Polylepis weberbaueri Pilger 2500 - 4200 AN, CA, LA, LI, PI Fuente: Extraído de (8) 36 2.2.2.6 Descripción de especies de Polylepis en estudio 2.2.2.6.1 Polylepis incana Árbol de 4 - 8 m de alto; ritidomas color marrón, de vaina estipular. Hojas agrupadas en el extremo de las ramas; pecíolo de 1.5 - 2 cm de largo, ligeramente villoso; hojas de 2.5 - 6.0 cm x 2 - 3.5 cm, con 1 - (2) pares de foliolos, raquis ligeramente villoso, con punto de unión de los foliolos con un mechón de pelos; base acuminado, ápice acuminado, margen completamente crenado, envés densamente panoso además y con una capa moderada a densamente villoso, mezclado con tricomas glandulares amarillentos, haz ligeramente piloso a moderadamente villoso, con pelos glandulares marrones, dispersos principalmente en la depresión de la vena media (Figura 1). (65). Fuente: Extraído de (65) Figura 1. Polylepis incana Humboldt, Bonpland & Kunth, 37 2.2.2.6.2 Polylepis rodolfo-vasquezii Figura 2. Polylepis rodolfo-vasquezii L. Valenzuela & I. Villalba. Fuente: Extraído de (35) 2.2.2.7 Categorización de riesgo 2.2.2.7.1 Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN) Según la IUCN (5) existen 14 especies del género Polylepis que están categorizadas como vulnerables, dentro de las cuales se encuentra la especie Polylepis incana. 2.2.2.7.2 Ministerio de Agricultura y Riego (MINAGRI) Según el Decreto Supremo N° 043-2006 AG del (10) en el que se establece la “Aprobación de la categorización de especies amenazadas de flora silvestre”. En el artículo 1º: Se establece la categorización de las especies amenazadas que se encuentran dentro de nuestro territorio con fines de adoptar medidas de conservación y la utilización sostenible de la Diversidad Biológica, para el cual utiliza un conjunto de criterios relevantes para todas las especies y 38 en todas las regiones del mundo, para evaluar el riesgo de extinción de miles de especies y subespecies. En dicho reglamento se hace mención a 13 especies del género Polylepis de los cuales Polylepis incana kunth esta categorizado como En peligro crítico (CR). 2.2.2.8 Morfometría celular La descripción anatómica y morfológica de los seres vivos ha sido uno de los estudios más importantes que se ha llevado a cabo desde inicios de la biología, ello con el fin de observar y analizar diferencias entre especies y dentro de una misma (66). Inicialmente, las descripciones de la forma de un organismo completo o de alguna de sus partes se hacían cualitativamente (67), es decir, se comparaban con alguna forma fácilmente reconocible, usando términos como en forma de círculo, forma alargada, fusiforme, entre otros. A inicios del siglo XX ocurrió una transición en la biología, cambiando de estudios descriptivos a una ciencia más cuantitativa (68), lo que resultó en el desarrollo de la morfometría, que es “el estudio cuantitativo de la variación de las formas biológicas” (69). Por lo cual, la morfometría se puede utilizar para describir la forma de cualquier objeto que se utiliza principalmente en la biología para describir los organismos. Asimismo, es muy importante en la biología porque permite realizar descripciones cuantitativas de organismos y con ese enfoque cuantitativo permitió a los científicos comparar las formas de los diferentes organismos de una mejor manera (34). 2.2.2.9 Anatomía vegetal del mesófilo Epidermis La epidermis es el tejido protector vivo que reviste a toda la planta cuando esta posee estructura primaria. Solamente se considera que falta la epidermis en la caliptra y que aún no está diferenciada en los ápices del tallo. Tiene la función protectora y actúa mecánicamente, 39 contribuyendo en parte al sostén debido a la compacidad de sus células. Las células epidérmicas están revestidas exteriormente por una capa más o menos gruesa de cutícula, formada por cutina y producida por el protoplasma de las células epidérmicas. La cutícula restringe la transpiración, evitando la pérdida excesiva de agua. El intercambio de gases incluyendo al agua en estado de vapor se realiza por las estomas, estructuras epidérmicas que se consideraran más adelante. El tejido epidérmico puede cumplir también otras funciones: secreción, percepción de estímulos, etcétera. También, aunque en forma excepcional, pueden hallarse epidermis con células con cloroplastos, fotosintetizantes (70). Estomas Son aparatos formados por dos células epidérmicas especializadas, llamadas oclusivas o de cierre, que limitan entre ambas una abertura de origen esquizógena, llamadas ostiolo. El ostiolo pone en comunicación el aire circundante con el que se encuentra en los espacios intercelulares subyacentes a la epidermis. De esta manera, el estoma en una estructura que permite el intercambio gaseoso, regulando la transpiración y el cambio de gases. El estoma puede estar rodeado por células similares a las demás epidérmicas o por otras diferentes en forma y disposición. En ambos casos se las llama células anexas o subsidiarias. El conjunto de las células oclusivas y las anexas forman el aparato estomático. El estoma puede hallarse al mismo nivel que las células epidérmicas, algo más elevado que ellas en las higrófitas y hundido más o menos profundamente o en concavidades producidas por repliegues epidérmicos (criptas estomatóforas) en muchas plantas xerofitas. 40 Las células oclusivas, cuya estructura y contenido posibilitan los movimientos estomáticos, tienen caracteres singulares que las distinguen del resto de las células epidérmicas: sus paredes están desigualmente engrosadas y el citoplasma posee cloroplastos y también puede acumular almidón. Las formas de las células oclusivas y los tipos de engrosamiento de sus paredes varían según el grupo taxonómico considerado. En muchas monocotiledóneas no gramíneas y en la mayoría de las dicotiledóneas tienen la forma esquematizada en la (Figura 3 B). Las células oclusivas son reniformes y las paredes celulares más alejadas del ostiolo son más delgadas de las que forman la abertura (70). Figura 3. Morfología y tipos de movimientos en las células oclusivas de los estomas. Ref: A) Tipo gramíneas; B) Tipo dicotiledóneas, a)estoma cerrado; b) estomas abierto Fuente: Extraído (70) El estoma de tipo gramíneas está representado en la (Figura 3 A). Las células oclusivas tienen forma de pesas de gimnasta y sus 41 paredes son delgadas en los extremos (sacos polares) y muy engrosadas en la parte media. La pérdida de agua que las plantas experimentan por los estomas puede llegar a ser muy importante. Se ha podido medir que entre la mitad y las 6/7 partes del agua de lluvia vuelve a la atmósfera por evapotranspiración, es decir, por lo que evapora el suelo y transpiran las plantas, y que la perdida de agua por vía estomática es tres veces mayor que la evaporada por el suelo. La evaporación del agua también contribuye al enfriamiento de las hojas. La apertura del estoma no es una respuesta obligatoria a la acción de la luz y los estomas pueden estar cerrados, aunque se hallen iluminados, cuando la provisión de agua es insuficiente. Las células oclusivas permiten la apertura del estoma en respuesta a bajas concentraciones de CO2 en el mesófilo (70). Parénquima Los parénquimas son tejidos fundamentales que prevalecen en la mayoría de los órganos vegetales formando un todo continuo. Constituyen la mayor parte de la corteza y de la médula de los tallos y raíces, el mesófilo de las hojas, la parte carnosa de los frutos, gran parte de las semillas (endosperma y la mayor parte del embrión), etcétera. También hay parénquimas acompañando a los tejidos conductores. La mayoría de las reacciones químicas (metabolismo) que ocurren en las plantas se producen en los parénquimas. Son, por lo tanto, tejidos formados por células vivas, muchas veces notablemente vacuolizadas y con núcleos relativamente pequeños y casi siempre con paredes primarias delgadas, aunque existen parénquimas con gruesas paredes primarias donde las hemicelulosas prevalecen como sustancias de reserva, como en las semillas del caqui (Diospyros kaki' y en los dátiles (Phoenix dactylifera). Las células del 42 parénquima xilemático secundario tienen paredes secundarias, lo que es una excepción entre las células vivas. La forma de las células parenquimáticas puede ser muy variable: más o menos isodiamétricas y facetadas, casi poliédricas o alargadas, lobuladas, etcétera. Los citoplasmas se intercomunican mediante plasmodesmos, generalmente concentrados en los campos de puntuaciones primarias y entre las células son frecuentes numerosos espacios intercelulares (meatos) de origen esquizógeno (gr.: esquizo: dividir, hendir) que pueden resultar muy grandes en los aerénquimas. Los parénquimas pueden ser considerados como meristemos potenciales ya que sus células no han perdido la capacidad de división. Esta característica se pone de manifiesto por su actividad en la cicatrización de las heridas, formación de órganos adventicios, en la soldadura de tejidos durante la injertación, etcétera. Si bien los parénquimas pueden considerarse como tejidos filogenéticamente primitivos, ya que se los encuentra en muchos vegetales inferiores constituyendo la casi totalidad del cuerpo (ciertas talófitas) y por su aspecto son morfológicamente simples, también cabe hacer notar que presentan gran complejidad en las reacciones bioquímicas que ocurren en sus protoplastos. La clasificación de los parénquimas (Figura 4.) puede hacerse según dos criterios. Por su ubicación en la planta, se reconocen los parénquimas corticales, medulares, asociados al tejido conductor, mesófilo, etcétera. Por su función, pueden distinguirse los asimiladores, fotosintéticos y verdes; los reservantes, que pueden contener almidón, grasas, proteínas, etc.; los acuíferos, acumuladores de agua en plantas suculentas (cactáceas, Aloe, etc.) y los aeríferos (aerénquimas), típicos de muchas plantas acuáticas y palustres, donde el aire se encuentra en los meatos aumentando la 43 flotabilidad y posibilitando la aireación de los órganos sumergidos (70). Figura 4. Tipo de parénquima: A) Clorofiliano (Clorénquima) en empalizada; B) Cortical; C) Clorofiliano, lagunoso; D) Aerénquima. Fuente: Extraído (70) 2.2.2.10 Estudio citogenético Como parte de la citología dentro de esta se estudia el ciclo celular que sucede en el tejido meristemático en células en proceso de división. Los estudios a nivel celular consta de un procedimiento como: la selección del material vegetal, pre tratamiento de la muestra, fijación, hidrólisis, tinción, preparación de placa (“squash”), análisis al microscopio, obtención de microfotografías, documentación y tabulación de resultados, evaluación del índice mitótico parcial como total, y el cálculo de la duración en horas del ciclo celular considerando un valor medio para un ciclo completo (68; 69). a) Número cromosómico El número cromosómico (número básico de cromosomas y el nivel de ploidía), provee información importante para resolver problemas 44 taxonómicos y comprender las tendencias evolutivas (73). El conocimiento del número cromosómico de especies es vital para estudios cito taxonómicos, evolución y relaciones filogenéticas (71; 72). El número cromosómico dentro de una misma especie puede variar por poliploidía, por lo que nuevos números básicos que no tengan relación directa con los ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas restructuraciones o hibridaciones entre poliploides con diferentes números básicos (76). b) Proceso de hibridación La especiación híbrida es muy común en el reino vegetal, en especial la especiación originada por poliploidía (77). La disponibilidad de nuevos nichos, promueve que las especies que deseen ocuparlos se adapten modificando su morfología y fisiología, el cual se alcanza mediante mecanismos macro evolutivos como la poliploidía que modifica el genotipo y consecuentemente el fenotipo dependiendo de las nuevas circunstancias del entorno (78). c) Poliploidía Representa el ADN nuclear o también conocido como “valor C”, que conlleva a cambios en el número cromosómico y en la estructura física de la especie que lo experimente (78). Este mecanismo de adaptación se clasifica según su origen en autopoliploidía y alopoliploidía. El primero, presenta un sólo tipo de genoma procedente de una única especie parental (monofilética). 45 Figura 5. Especiación simpátrica por autopoliploidía en la plantas. Fuente: Extraído de (79) El segundo mecanismo, presenta más de un tipo de genoma y, por tanto, procede de la hibridación de dos o más especies (polifilética). En ocasiones, se desconoce el origen de alguno de los genomas de una especie alopoliploide, pudiendo pertenecer a una especie parental extinta o no descubierta. Dentro de los mecanismos citológicos que inducen poliploidía en las plantas se encuentran la duplicación somática y la no reducción de gametos; si bien del primero no se tiene un amplio conocimiento sobre su frecuencia en plantas ni de sus efectos en la hibridación interespecífico, se conoce que este mecanismo es el de mayor generación de poliploides (80). Figura 6. Mecanismo de especiación alopoliploide en las plantas. Fuente: Extraído de (79) 2.2.3 Metodología existente 2.2.3.1 Método de morfometría de células guardianas de estomas 46 Este protocolo fue establecido por (27) con modificaciones. a) Colección de muestras Se utilizan hojas de 10 árboles de cada población de Polylepis. Se escogió 3 foliolos frescos por cada árbol de cada población. b) Preparación de muestras Se descartan los tricomas del envés de las hojas con un bisturí, para las especies que presenten densidad de tricomas. Se fijó cada folíolo por su envés a un portaobjetos con pegamento de cianoacrilato, se eliminó el haz del folíolo hasta evidenciar el tejido epidérmico de la parte superficial del envés, se aplicó acetona para eliminar el remanente de clorofila. c) Preparación de placas y medición Luego se procede a desprender cuidadosamente con el bisturí la capa del envés y se colocó con una gota de agua destilada sobre el portaobjetos con su respectivo cubreobjetos. Con el microscopio se fotografió diez células oclusivas por folíolo a un aumento de 400X, se midió su longitud en micrómetros empleando el programa ImageJ 1.49v, posteriormente se realizó análisis estadísticos con los datos obtenidos para correlacionar datos. 47 2.2.4 Diseño de modelo teórico conceptual 48 2.3 Definición de términos básicos 2.3.1 Poliploidía El grado de replicación del cromosoma establecido en el cariotipo (88). 2.3.2 Cromosomas En una célula procarionte o en el núcleo de una célula eucarionte, estructura constituida por ADN o que lo contiene, que lleva la información genética esencial a la célula (88). 2.3.3 Adaxial Parte del órgano situada hacia el eje portador. Lo contrario de ABAXIAL (89). 2.3.4 Abaxial Superficie de un órgano situada del lado contrario al eje que la soporta. Cara inferior de la hoja. Se opone a ADAXIAL (89). 2.3.5 Mesófilo Conjunto de tejidos ubicados entre ambas epidermis y entre los nervios en una hoja (89). 2.3.6 Híbridos Progenie heterocigota de dos padres genéticamente distintos (88). 2.3.7 Taxonomía Ciencia de la clasificación de los organismos; ordenamiento de los organismos en grupos sistemáticos tales como especie, género, familia y orden (88). 2.3.8 Polylepis spp Polylepis (Rosaceae) es un género de plantas de forma de vida arbórea o arbustiva, de 1 – 6 m de altura y un diámetro de copa de 3 – 5 m (90), característico por sus formas retorcidas, una corteza gruesa y escamosa de color rojizo, y pequeñas hojas de color verde grisáceo. 49 2.3.9 Células oclusivas Células estomáticas que definen un orificio llamado ostiolo. Tienen la capacidad de hincharse y deshincharse intercambiando agua con otras células epidérmicas anejas (91). 2.3.10 Morfometría Medición de la forma o estructura de los organismos y sus partes (88). 2.3.11 Parénquima Tejido vegetal de los denominados "fundamentales". La forma y función de las células parenquimáticas es muy variable, pero todas tienen en común el carecer de pared secundaria o tenerla muy fina y poco o nada lignificada y el ser células vivas con un metabolismo más o menos activo (91). 2.3.12 Ploidía Es el número de series de cromosomas (91). 2.3.13 Citotipos Se refiere a un individuo que se distingue de los demás por su ploidía y que tiene un factor cromosómico diferente que otro (91). 2.3.14 Altitud Es la distancia vertical entre un punto situado sobre la superficie terrestre o la atmósfera y el nivel medio del mar (92). 50 CAPITULO III METODOLOGÍA 3.1 Método y alcances de la investigación 3.1.1 Método de la investigación 3.1.1.1 Método general o teórico de la investigación Para este estudio se utilizó el método analítico porque se hicieron mediciones morfométricas de las muestras (hojas). 3.1.1.2 Método específico de la investigación Se utilizó el método de la observación porque el conjunto de datos que se presentan naturalmente fueron observados en laboratorio, luego se organizaron y se hizo una interpretación estadística que responderán los objetivos del estudio. 3.1.2 Alcances de la investigación 3.1.2.1 Tipo de investigación La investigación es básica porque se pretendió obtener nuevos conocimientos de descripción morfométrica de células y tejidos de la hoja relacionándolo con la altitud y el número cromosómico. En este estudio se 51 realizó la correlación de estas variables para la especie Polylepis rodolfo- vasquezii y Polylepis incana. 3.1.2.2 Nivel de investigación La investigación es de nivel descriptivo - correlacional. Es descriptivo porque su interés se basó en describir las características de variables para adquirir información, y correlativo porque se reconoció el grado de asociación entre los componentes morfométricos, altitud y el número cromosómico de las especies P. rodolfo-vasquezii y P. incana. 3.2 Diseño de la Investigación 3.2.1 Tipo de diseño de investigación. Debido a que las características morfométricas (datos) no se manipularán y solo se observarán tal y como se dan en su contexto, se planteó un diseño descriptivo simple y correlacional no experimental, con 3 variables y tres dimensiones, de la siguiente manera: Ox P M r Oy P: Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana M: Características morfométricas Ox: Número cromosómico Oy: Altitud 3.3 Población y muestra 3.3.1 Población La población de estudio comprende los árboles pertenecientes a las especies Polylepis rodolfo-vasquezii y Polylepis incana, encontrados en los bosques de Paucho, Quilcaycocha, Toldopampa y Dorado respectivamente, ubicados en las 52 provincias de Concepción (distrito Comas), Satipo (distrito Pampa Hermosa) y Huancayo (distrito El Tambo), pertenecientes a la Región Junín. 3.3.2 Muestra 3.3.2.1 Tamaño de muestra La muestra es no probabilística, se seleccionaron a los árboles en función a una distancia mínima de 10 m entre cada árbol para evitar la colecta de clones. En este caso, se seleccionaron 20 árboles al azar por bosque que presenten una apariencia y desarrollo promedio (93), siendo un total de 80 árboles seleccionados entre las dos especies estudiadas (Polylepis incana y Polylepis rodolfo-vasquezii). 3.3.2.2 Selección de la muestra Para muestras empleadas en los trabajos de laboratorio, de los 20 árboles, se seleccionó la muestra de la parte media del árbol (Figura 7.) para evitar elegir muestras sesgadas. Figura 7. Altura del árbol de donde se seleccionó la muestra. Fuente: Elaboración propia Una vez identificado la zona idónea de la parte media del árbol, se colectó una rama expuesta al sol de 25 cm de largo, sin considerar el brote foliar (94). 53 Figura 8. Selección de la muestra (Rama de aproximadamente 25 cm). Extraído de (39). 3.3.2.3 Unidad muestral La unidad muestral está representada por las hojas que comprenden la muestra. 3.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos 3.4.1 Técnicas utilizadas en la recolección de datos 3.4.1.1 Fase de campo 3.4.1.1.1 Área de estudio Se trabajó en cuatro bosques de dos especies del género Polylepis los cuales se colectaron en el Departamento de Junín, en los distritos de El Tambo, Comas y Pampa Hermosa. 54 Figura 9. Bosque Dorado (Polylepis incana). 55 Fuente: Elaboración propia Fuente: Elaboración propia Figura 10. Bosque Paucho (Polylepis rodolfo-vasquezii). 56 Figura 11. Bosque Quilcaycocha (Polylepis rodolfo- vasquezii). Fuente: Elaboración propia Figura 12. Bosque Toldopampa (Polylepis rodolfo-vasquezii). Fuente: Elaboración propia 3.4.1.1.2 Metodología para el proceso de muestreo Se seleccionaron 20 árboles de los bosques de Quilcaycocha, Paucho, Toldopampa y el Dorado. Asimismo, de cada árbol seleccionado se colectó una rama sin signos de senescencia y con evidencia de no estar severamente afectado por patógenos. Asimismo, se tomaron las coordenadas UTM de cada árbol. a) Codificación La codificación que se asignó a cada árbol estuvo en función a las 3 primeras letras del nombre del bosque y la unión con el N° del árbol. Por ejemplo, para el bosque Dorado y el árbol o punto de muestreo N°5 el código fue (DOR-05). 57 b) Transporte de muestras Para el transporte de muestras se procedió a almacenarlos en bolsas ziploc (con cierre hermético) y posteriormente a un Cooler. 3.4.1.2 Fase de laboratorio 3.4.1.2.1 Conservación de muestra vegetal Para la conservación de las muestras se preparó una mezcla de alcohol al 90 % con glicerina al 80 % (81), y dentro un microtubo Eppendorf de 1 ml se vertió la mezcla junto a la muestra, para luego ser guardado en una gradilla y posterior a ello se almacenaron en condiciones de refrigeración a 4°C. 3.4.1.2.2 Características morfométricas a) Células guardianas de estomas Para la observación de las células guardianas de estomas se escogieron aleatoriamente 3 hojas de la rama en transición de jóvenes a maduras, luego se procedió a limpiar los tricomas de las hojas que los presentaban, posterior a ello se vertió un poco de SuperGlue (cianocrilato) para luego posarlo en un portaobjetos. Después se inició con el despegue de la hoja del portaobjetos procurando obtener una película del envés de la hoja en la que se observaron los estomas. Posteriormente, en el microscopio se comenzó a visualizar a un aumento de 40X paralelamente a tomar las medidas del largo de las células oclusivas de 10 estomas tomadas aleatoriamente entre toda el área del foliolo. Se hizo este mismo procedimiento para las otras dos hojas. b) Células epidérmicas y tejidos del parénquima clorofiliano Para la observación de las células epidérmicas y del parénquima clorofiliano se utilizaron foliolos en transición de jóvenes a maduras, de las cuales se realizaron cortes transversales de las hojas con preparaciones en fresco. Cada corte fue lo más delgado 58 posible, se las dejó en alcohol por 5 minutos para quitar restos de clorofila para que la visualización sea lo más claro posible, luego se dejó secar a temperatura ambiente durante 7 minutos para evitar el desprendimiento de las epidermis. Posterior a ello se montaron en portaobjetos y cubreobjetos y se observaron al microscopio para identificar las epidermis, el tejido parenquimatoso (empalizada y esponjoso), y se procedió a tomar medidas, al mismo tiempo se tomaron fotografías con el software de la cámara acoplada al microscopio a un aumento de 10X, la medida de los tejidos se realizó en la parte media para ambos lados que divide el haz vascular principal o primario. c) Espesor de la hoja El espesor de hoja se midió aprovechando la toma de medidas de la epidermis y el tejido parenquimatoso, también en ambas partes que divide el haz vascular principal. d) Área de la hoja Del segmento de 25 cm de la rama colectada, se escogieron 10 hojas, en transición de jóvenes a maduras completamente expandidas. Las hojas extraídas se colocaron en papel bond para posteriormente escanearlas a 2400 ppp (puntos por pulgada) en un scanner Epson L210, evitando que no estén sobrelapadas. Se colocó una regla al lado de las muestras para la referencia de escala. Las muestras fueron procesadas con el programa ImageJ, en donde se obtuvo el área foliar. 3.4.2 Técnicas e instrumentos de investigación 3.4.2.1 Técnicas de investigación 3.4.2.1.1 Tratamiento de muestras Para el tratamiento de muestra se emplearon técnicas que permitieron conservar las muestras por periodos razonables, 59 además técnicas de cortes de muestra vegetal para obtener imágenes de mejor calidad. Técnicas de conservación de muestras vegetales a) Método de alcohol-glicerina Esta técnica de conservación permitió la deshidratación del material, haciéndolo más flexible y para que no se desarrollara hongos; las partes vegetativas se conservaron en un 85 - 90 % de alcohol - glicerina (81). b) Cortes histológicos Se realizaron cortes de secciones de la muestra, lo más finas posible, para poder ser observadas con el microscopio. Los cortes se hicieron a mano usando bisturí (cortes a mano alzada) (83). 3.4.2.1.2 Observación microscópica Las técnicas de microscopía óptica y sus aplicaciones permitieron distinguir las estructuras internas del mesófilo (células y tejidos) que fueron mostradas a través de la proyección de imágenes a una computadora, que posteriormente permitieron realizar las mediciones, utilizando un software (ToupView) como parte de la cámara que conecta al microscopio. 3.4.3 Instrumentos utilizados en la recolección de datos 3.4.3.1 Fase de campo a) Colección de muestras Para la colección y georeferenciación de muestras se utilizaron: 60  Equipo: GPS y cámara fotográfica.  Material: Tijeras de podar. b) Almacenamiento de muestras Para el almacenamiento de las muestras se utilizaron:  Materiales: Bolsas ziploc y marcador. c) Transporte de muestras Para el transporte de las muestras de utilizó:  Material: Cooler. 3.4.3.2 Fase de laboratorio a) Tratamiento de muestras Para el tratamiento y conservación de las muestras se utilizaron:  Equipo: Nevera.  Materiales: Bisturí, hojas de afeitar, cubre y portaobjetos, papel toalla, luna de reloj, piseta, marcador, gradilla y microtubos Eppendorf.  Reactivos: Agua destilada, alcohol 90 %, glicerina y Superglue (cianoacrilato). b) Medición de muestras Para la medición de las muestras se utilizaron:  Equipos: Microscopio, cámara de microscopio y laptop.  Software: ImageJ V.1.48 y ToupView V.3.7 c) Análisis estadístico de muestras: Para los análisis estadísticos se utilizaron: 61  Equipo: Laptop.  Software: Microsoft Excel 2013 y SPSS Statistics 24. Estos fueron utilizados con la licencia de software de la Universidad Continental. 3.5 Técnica de tratamiento de datos Para el procesamiento de datos se utilizó el software libre ImageJ 1.48V y ToupView V.3.7, para el tratamiento de los datos se utilizaron los programas de procesamiento y análisis estadístico: Microsoft Excel 2013 y SPSS Statistics 24.; se realizaron los siguientes tratamientos. 3.5.1 Estadística descriptiva Se aplicó la estadística descriptiva para comprender las características métricas de la estructura general de los datos. a) Pruebas paramétricas Se aplicó pruebas paramétricas para obtener una estimación de los parámetros de la población con base en las muestras estadísticas, como la prueba de Kolmogorov-Smirnov (n > 50), para determinar la normalidad de los datos. b) ANOVA Para todos los parámetros se realizó el análisis estadístico de ANOVA con un nivel de confianza del 95 % para conocer si existen diferencias significativas en los componentes evaluados entre los 4 bosques y para ambas especies de Polylepis sp. c) Test de Duncan Se aplicó el test para comparar las medias de los t niveles de un factor y poder observar las diferencias existentes entre las poblaciones o bosques de estudio 62 después de haberse rechazado la Hipótesis nula de igualdad de medias mediante la técnica ANOVA. d) Análisis de regresión Se aplicó el análisis de regresión para conocer el grado de asociación - coeficiente de correlación (r), entre las variables características morfométricas, número cromosómico y la altitud. e) Correlación de Pearson Se desarrolló la prueba de correlación para conocer la fuerza y la dirección de la relación lineal y proporcionalidad entre las variables. Para la correlación se utilizaron los datos de características morfométricas, altitud y base de datos externos como número cromosómico de las especies Polylepis incana y Polylepis rodolfo-vasquezii, que fueron proporcionados por el Proyecto 149 – Concytec. 63 CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Resultados del tratamiento y análisis de la información 4.1.1 Características morfométricas de células y tejidos de la hoja 4.1.1.1 Características morfométricas de células oclusivas de estomas Las células oclusivas medidas de P. incana y P. rodolfo-vasquezii (Figura 13), presentaron similitud en su estructura arriñonada, sin embargo, la principal diferencia radica en el tamaño promedio de estas. De las muestras analizadas se obtuvo que el bosque con mayor valor promedio para el tamaño de las células oclusivas (Figura 14) fue el Bosque Dorado perteneciente a la especie P. incana con un valor promedio de 20.45 m, seguido del Bosque Toldopampa con 17.05 m, el Bosque Paucho con 16.45 m y finalmente el Bosque Quilcaycocha con 15.29 m, estos tres últimos pertenecientes a la especie P. rodolfo-vasquezii. Figura 13. Células oclusivas de estomas. A) P. incana, B) P. rodolfo- vasquezii. Abreviatura: Es: Estoma. Fuente: Elaboración propia. A B Es Es 16.43 µm 20 µm 20 µm 21.35 µm 64 Fuente: Elaboración propia. Pruebas estadísticas a. Prueba de normalidad Hipótesis: α = 0.05 H0: Los datos provienen de una distribución normal H1: Los datos no provienen de una distribución normal Tabla 6. Datos del p-valor para el test de Normalidad de Kolmogorov- Smirnov, en la morfometría de células oclusivas de